L'Open Antibodies Project és una col·laboració de recerca global promoguda conjuntament per UC Davis, NIH NeuroMab Facility, DSHB i Addgene. Té com a objectiu abordar la crisi de reproductibilitat d'anticossos mitjançant l'estandardització, la transparència i l'intercanvi obert. La seva implementació no és una iniciativa solta, sinó un procés d'enginyeria de sis-passos que és executable, auditable i reproduïble.
1. Adquisició i tramesa estandarditzades de seqüències gèniques d'anticossos
Font: les cèl·lules B específiques de l'antigen-s'aïllen d'animals immunitzats o pacients recuperats mitjançant la tecnologia de classificació de cèl·lules B individuals (com ara FACS). L'ARNm de BCR s'extreu i s'amplifica per RT-PCR per obtenir les seqüències V(D)J completes de les cadenes lleugeres i pesades.
Requisits de format: la seqüència ha d'estar en format FASTA i incloure anotacions per als fragments de gens V, D i J.
S'ha d'incloure informació sobre l'immunogen (nom de l'antigen, espècie, procediment d'immunització).
S'ha d'indicar l'origen de la clonació (p. ex., "donant humà núm. 27, infecció post-SARS-CoV-2").
Plataforma d'enviament: envieu dades de seqüència en brut mitjançant el formulari "Suggereix un plasmidi" d'Adgene.
Punts clau: La seqüència ha de ser un gen d'anticossos recombinant; està prohibida la presentació d'anticossos no seqüenciadors derivats d'hibridomes.
2. Construcció de plasmidis i muntatge de vectors d'expressió d'enginyeria
Selecció de vectors: Utilitzeu vectors d'expressió estàndard de mamífers (p. ex., pCMV o pEF1), assegurant la inclusió de la regió constant de IgG1 Fc i la seqüència de Kozak.
Mètode de clonació: utilitzeu el muntatge Gibson o la clonació Golden Gate per aconseguir un aparellament natural de cadenes pesades i lleugeres, evitant combinacions aleatòries.
Convencions de denominació de plasmidis:
OpenAb_[Antigen]_[Espècie]_[CloneID]_v1
Exemple: OpenAb_SARS2_Spike_hu_047_v1
3. Enviament i revisió mitjançant la plataforma Addgene
Entrada d'enviament: accediu al formulari Addgene Suggest a Plasmid
Criteris de revisió: seqüència lliure de contaminació i mutacions de frameshift; El plasmidi conté promotor i terminador complets; Proporcioneu un mapa de plasmidis (fitxer .gb)
Temps de revisió: normalment entre 7 i 14 dies laborables. Després de l'aprovació, s'assigna un ID Addgene (per exemple, #123456) i el plasmidi s'afegeix públicament a la base de dades.
Resultat: el plasmidi es converteix en un recurs de cerca global, disponible de manera gratuïta per a qualsevol investigador.
4. Generació i càrrega estandarditzada de dades de validació
Mètodes de validació: ha de complir els cinc pilars de l'IWGAV (Grup de treball internacional sobre validació d'anticossos):
|
Tipus de validació |
Mètode |
Requisits |
|
Validació genètica |
Eliminació / eliminació CRISPR de la proteïna objectiu |
Desaparició o reducció important de les bandes WB |
|
Validació ortogonal |
Comparació amb resultats d'espectrometria de masses o ARN-seq |
Patró d'expressió coherent |
|
Validació independent d'anticossos |
Validació-creuada mitjançant anticossos amb epítops diferents |
Resultats consistents |
|
Validació funcional |
Assaig de neutralització, citometria de flux |
Demostra la funció biològica esperada |
|
Validació de l'aplicació |
IHC, IF, WB, FC |
Tinció específica per a l'aplicació diana |
Format de dades:
Imatges IHC/IF: han d'incloure control negatiu (teixit eliminador) i control positiu.
Imatges WB: han d'incloure marcadors de pes molecular i controls interns (p. ex., -actina).
Totes les imatges s'han de penjar en format TIFF sense pèrdues, juntament amb els paràmetres experimentals (proporció de dilució d'anticossos, temps d'exposició).
Requisit obligatori: totes les dades de validació s'han de publicar juntament amb els plasmidis; tampoc és prescindible.
5. Distribució i ús gratuït global
Mètode d'accés:
Visiteu Addgene Antibody Plasmid Collection
Cerca l'anticossos objectiu (p. ex., "OpenAb_SARS2_Spike")
Envieu un Acord d'ús no-comercial (no cal fer cap pagament)
Rebre plasmidi (generalment entre 5 i 10 dies laborables)
Directrius d'ús:
L'identificador Addgene i la font de la seqüència original s'han de citar al document.
Animeu l'enviament de dades de validació noves a Addgene per formar un ecosistema de bucle tancat-.
6. Retroalimentació contínua i iteració dels ecosistemes
Mecanisme de retroalimentació de dades: els usuaris carreguen nous resultats experimentals (per exemple, noves aplicacions, noves reactivitats d'espècies) a la plataforma Addgene, formant una base de dades de validació dinàmica.
Govern de la comunitat: DSHB i NIH publiquen regularment informes de qualitat d'anticossos, eliminant anticossos ineficients o de -reacció creuada.
Resultats: a partir del 2025, el 89% de la investigació que utilitza anticossos de codi obert-es pot reproduir de manera independent, superant amb escreix el 45% dels anticossos comercials.
